人工设计的核酸酶介导猪myostatin基因敲除的研究

【摘要】背景：Myostatin基因为肌肉生长抑素基因,又称为生长／分化因子8(GDF8),它属于TGF-β超家族的成员之一,该基因与肌肉的生长发育相关,是肌肉生长发育的负调控因子。在哺乳动物中,自然突变或者人工突变引起的myostatin基因失活都可以引发骨骼肌数量的增加,增加家畜产瘦肉的能力,从而提高家畜的生产性能,其为提高家畜生产效率的研究开辟了一条新的途径。人工敲除myostatin基因的方法有同源重组打靶、RNAi干扰和人工设计核酸酶切割三种方法,但同源重组打靶效率低、耗时长；携带siRNA的病毒载体随机插入引起机体功能紊乱的风险较高；而且以上两种方法都将向动物基因组中引入外源基因；人工设计核酸酶进行基因敲除不仅效率较高且极大的降低了引入外源基因的风险。人工设计核酸酶由可以识别并结合特定DNA序列的锌指蛋白和对DNA序列进行非特异切割的FokI核酸酶组成,其对基因组进行切割时会产生DNA双链断裂(DSB),DSB主要由细胞胞内两种修复机制进行修复—-同源修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ),尤其是NHEJ在修复过程中往往会造成小片段的插入和缺失,造成遗传信息的丢失,从而达到基因敲除的目的。方法和结果：本研究设计了两种不同的靶向猪myostatin基因第一外显子的人工设计核酸酶,并对其在猪源细胞水平和胚胎水平上敲除myostatin基因的有效性和活性进行了探索。结果如下：(1)使用核转染的方法将ZFNs和TALENs分别导入PEF细胞中,并培养48h或72h,提取细胞基因组进行nyostatin基因的PCR扩增,并进行T7EI切割实验和DNA序列实验。结果显示ZFNs和TALENs在细胞水平上都对myostatin基因进行了敲除,ZFNs的敲除效率为4.8%,而TALENs为11.1%,要显著高于ZFNs。(2)将ZFNs和TALENs进行体外转录,将其转换为mRNA并对激活的猪卵母细胞进行显微注射,检测其在胚胎水平的的有效性和活性。由于猪卵母细胞对温度的变化非常敏感,所以不同季节注射的胚胎发育囊胚的比率不同(p<0.05),夏季较高而冬季较低；但是与对照组相比,实验组胚胎发育至囊胚的比率并没有显著差异(p>0.05),这说明显微注射程序和编码ZFN蛋白的mRNA对于胚胎的生长发育并没有显著的影响。采集发育至囊胚的胚胎,扩增myotatin基因并进行T7EI切割实验和DNA序列实验；结果显示,ZFNs和TALENs在胚胎水平同样对myostatin基因进行了敲除,并表现出了与细胞水平上相似的敲除效率,其效率分别为5.31%和11.3%；但在发育于囊胚的细胞中,用ZFNs和TALENs处理的胚胎其突变细胞所占的比例不同,ZFNs要远远高于TALENs。结论：本研究中两种不同的人工设计核酸酶(ZFNs和TALENs)在细胞水平上和胚胎水平上都成功敲除了myostatin基因,无论是在细胞水平上还是在胚胎水平上TALENs对于myostatin基因的敲除效率都要高于ZFNs;这些为生产环保、高瘦肉率的myostatin基因缺失型猪提供了基础。
【作者】张宏晓；
【导师】刘红林；
【作者基本信息】南京农业大学，动物遗传育种，2013，硕士
【关键词】锌指核酸酶；转录激活样效应器核酸酶；肌肉生长抑素；基因敲除；

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